CRISPR技术：剪切拼接基因序列的“魔法剪刀”
Tania Louis
生物学博士、《瞰创新》撰稿人
CRISPR/Cas9技术作为一种基因编辑手段，具有巨大潜力，可以精准地编辑生物基因组。其原理基于细菌的天然免疫系统，通过指导蛋白(Cas)和RNA的配合来精确修饰DNA序列。这种技术不仅在基础科学研究中广泛应用，还在医疗、农业和生物生产等领域展现出巨大应用前景。CRISPR/Cas9技术在医学和农业领域的应用前景如何？它能否真正实现治疗基因相关疾病和改良农作物的目标？CRISPR/Cas9技术的局限性和风险是什么？如何解决其可能引发的伦理和法律问题？
CRISPR 是在许多原核生物的基因组中都存在的一种DNA 序列，是细菌抵御病毒入侵的一种防御手段。科学家们受启发，开发出了CRISPR基因编辑技术。
CRISPR/Cas系统通过切割基因、插入新基因，能够快速、精确地修改目标生物的遗传信息。
CRISPR的应用范围很广泛：基因治疗、医疗保健、农业、生物生产等。
CRIPSR/Cas引发了许多伦理问题，对于其潜在用途和影响众说纷纭，也在欧洲议会上引发了辩论。
随着去年欧洲议会放宽对转基因技术的限制[1]，一种叫做CRISPR/Cas9的基因编辑技术开始引发争议：一些人对它深表担忧，另一些人则抱乐观态度。本文将介绍CRISPR/Cas9的原理，以及这种技术蕴含的可能性、局限性和潜在挑战。
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CRISPR/Cas9，基础科研的诺奖成果
CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）是在许多原核生物（细菌、古细菌等）的基因组中都存在的一种DNA 序列，1987 年首次在大肠杆菌中发现[2]。在CRISPR序列中，有多个较短的重复序列，由间隔序列分隔开。经过 20 多年[3]的深入研究，学术界发现原来CRISPR系统是细菌抵御病毒入侵的一种防御手段[4]。
间隔序列其实是来自病毒的基因片段，由细菌主动整合到自己的基因组中。当病毒入侵，CRISPR DNA 会被转录成 RNA，RNA 又被切割成crRNA (CRISPR RNA)，作为引导分子。每个crRNA对应一个间隔序列，也就是说对应一种病毒。成熟的 crRNA与Cas 蛋白形成核糖核蛋白复合体，crRNA 引导 Cas蛋白定位病毒核酸，进行切割，达到免疫防御的目的，从而结束感染。
图片来源：PI France
因此，CRISPR/Cas抵御外来病毒入侵分三个步骤：1、crRNA的表达；2、crRNA识别病毒基因组；3、crRNA 引导 Cas 蛋白靶向切割病毒核酸。当原核生物遇到新病毒时，会将其的基因片段添加到自身的CRISPR记忆库中，因此 CRISPR/Cas免疫反应具有特异性（只针对一种病原体）。更重要的是，记忆库就存在于细菌的基因组中，可以“代代相传”。作为一种基因编辑手段，CRISPR系统操作简便，在微生物学界之外也广为人知。
02
使用 CRISPR/Cas9 修改基因组
CRISPR/Cas系统的基本原理，是将crRNA与Cas酶结合。crRNA负责将Cas酶带到某种生物基因序列中的目标位置，Cas酶充当“分子剪刀”，在特定位置切割 DNA。切割后，有几种可能性。其一，生物体自身存DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游两端的序列连接起来，从而实现了细胞中目标基因的敲除。其二，如果给细胞提供同源修复模板，模板就会被插入到切口里。
由于CRISPR/Cas9系统能在DNA 序列的任意位置进行切割，故适用于遗传信息的精准编辑——引入小小的基因突变、插入新基因、关闭某个基因的功能（即不给细胞提供同源修复模板）。现在，订购定制的crRNA简单又便宜，CRISPR已成为了一种有效易得的基因编辑技术。
“由于CRISPR/Cas9系统能在DNA 序列的任意位置进行切割，故适用于遗传信息的精准编辑。”
在原核生物中，Cas酶种类繁多，具有不同的功能和特性[5]。首个CRISPR系统使用的是Cas9，它可以对双链 DNA进行切割。然而，不同微生物产生的Cas酶，功能略有差异，剪切精度、剪切片段长度不尽相同。Cas12可以一次性编辑多个基因片段、进行表观遗传操控，也可用于病原体DNA检测。Cas13能切割RNA，故可用于检测病原体RNA，还能用于编辑tRNA，在不改变DNA的前提下影响基因的表达。
CRISPR/Cas基因编辑技术蓬勃发展，众多课题组正在这一领域开展研究。2012年，法国和美国科学家Emmanuelle Charpentier 和 Jennifer Doudna将首创的CRISPR/Cas9基因编辑技术在论文中公布与众[6]，于2020年荣获诺贝尔化学奖[7]。同期，其他的学者发表了使用CRISPR/Cas9编辑真核细胞基因组的初步结果，包括美籍华裔科学家张锋，及其合作者[8]、前导师 George Church [9]。这四位科学家后续都创办了基因编辑生物技术公司，而由于CRISPR/Cas 技术具有重大的经济价值，四人所属的院校已经打起了专利战。
03
CRISPR/Cas技术的应用
CRISPR/Cas 技术仅仅诞生了十年，却已成为生物学基础研究的实验室“标配”。由于能方便快捷地替换、修改基因，CRISPR/Cas很适合用于研究特定基因的功能。即使须要在整个基因组里筛查某些特定基因也不在话下。CRISPR的应用领域相当广泛，尤其在医疗、农业学和生物生产三个领域。
治疗单个基因功能障碍引起的疾病，CRISPR/Cas能大显身手。CRISPR/Cas9系统可作为一种新型基因疗法，把突变致病基因替换成功能正常的健康基因。2023年底，英国成为了第一个批准CRISPR/Cas治疗遗传疾病的国家。Vertex和CRISPR Therapeutics两家欧美企业联合开发的CRISPR/Cas疗法CASGEVY能治疗血红蛋白基因突变引起的慢性贫血，已在美国和英国获批。在法国，这种疗法于2024年1月18日获批提前准入[10]。
对于因少数基因异常导致的疾病，CRISPR/Cas简化了治疗，但它无法克服基因疗法的所有局限性。血液、眼睛、肝脏等器官易于CRISPR/Cas系统送达，但在不引起副作用的前提下，精准针对所有病变细胞仍是个挑战。CRISPR/Cas的潜在医学应用不限于基因治疗和诊断，还包括消灭艾滋病感染者体内的病毒[11]、对抗疟疾[12]、辅助器官移植[13]、治疗糖尿病[14]等，以上用途目前处于测试阶段。
图片来源: PI France
从古至今，农业和畜牧业一直在通过漫长的人工选择和杂交育种，筛选动植物的优良性状，这也是一种“基因修改”。分子生物学的发展彻底颠覆了传统模式。现在我们能更清楚地了解每个基因的作用，精准编辑，甚至插入新的基因，而不是在新一代动植物出生后再碰运气寻找突变，大大提高了效率。潜在的应用简直是无穷无尽：培育耐热、耐旱、抗病虫害特质（减少农药使用）；提高产量（减少化肥使用）；延长农作物存放期限以避免浪费；增加营养物质含量[15]等等…
CRISPR/Cas 实现的定向基因修改也可用于培育新型农产品，例如天然无咖啡因的咖啡豆[16]、无过敏原的作物。现在就有人在研发无麸质小麦[17]。如果不是删除基因而是插入新基因，就能将酵母、藻类或细菌等微生物变成“生物工厂”，合成生物燃料、药用化合物、化妆品原料、维生素等。简单易用、潜力无穷的CRISPR/Cas已经在合成生物学引发了一场技术革命。
04
CRISPR/Cas的局限性
CRISPR/Cas有时被描述得无所不能，但它也有局限性。即使精准编辑了一个生物的基因组，也不能保证表现型一定会改变。有些生理机制由多个基因控制，就算使用CRISPR/Cas，也无法轻易操控。基因对生物体的正常功能至关重要，对其进行修改可能会产生有害的后果。功能已知的基因，不能直接移植给别的物种，指望其拥有相关特性。在受控环境中用简化模型开展的实验，得到的结果未必能直接应用于实际。
更重要的是，CRISPR/Cas并非100%可靠，可能会出现脱靶现象，修改不该修改的基因序列。如果基因疗法期间发生脱靶，会有不利后果。除此之外，还有其他的技术挑战有待克服[18]。CRISPR/Cas疗法的可获性也是个问题。CASGEVY标价220万美元，就算能治愈疾病，价格仍太高，势必难以普及。
“虽然CRISPR/Cas的一些用途看似美好，但另外的一些用途会引发伦理道德困境。”
价格只是CRISPR/Cas技术引发的诸多社会伦理问题之一。就像任何技术一样，CRISPR/Cas本身没有好坏之分，一切由使用方式决定，包括短期内可实现的用途，以及未来有可能实现的用途。通过编辑基因治好不治之症，固然美好，但基因编辑可不是儿戏。2018年，南方科技大学原副教授贺建奎违法进行人类胚胎基因编辑活动，对若干个人类胚胎基因进行修改，试图使其天然具备艾滋病抵抗力。成果宣布后，贺建奎受到了学界的强烈谴责，以及法律的制裁，被判处有期徒刑三年，2022年刑满释放。虽然贺建奎的实验采取了违规手段，且违背伦理道德，但最后的确有两名基因编辑婴儿降生[19]。
伦理困境还有很多：该不该对植物进行基因改造，以提高其抗旱能力？该不该改造宠物猫，使其毛发不容易引发人类过敏[20]？蚊子传播的疾病每年导致数十万人死亡，该不该通过基因编辑大规模消灭蚊子种群[21]？如果你对三个问题的答案不同，原因是什么？
这些都是复杂的问题，但考虑到技术发展的速度之快，形成共识势在必行。欧盟的“六国集团”汇集了六大欧洲研究机构，包括法国国家科学研究中心（CNRS）。在欧洲议会最近的辩论中，CNRS发布新闻稿呼吁“应重视转基因生物性状引发的风险，而非转基因技术本身的风险。”[22] 未来会形成怎样的新法律法规呢？我们拭目以待。
作者
Tania Louis
编辑
Meister Xia
1. https://www.europarl.europa.eu/news/fr/press-room/20240202IPR17320/nouvelles-techniques-genomiques-et-transition-ecologique-des-agriculteurs
2. https://journals.asm.org/doi/10.1128/jb.169.12.5429–5433.1987
3. https://link.springer.com/article/10.1134/S0006297922080090
4. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1138140
5. https://link.springer.com/article/10.1007/s12033-022–00567‑0 Detailed, sourced overview of the function and potential applications of various Cas proteins
6. https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2020/press-release/
7. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1225829
8. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1231143
9. https://www.science.org/doi/10.1126/science.1232033
10. https://www.has-sante.fr/jcms/p_3490709/fr/casgevy-exagamglogene-autotemcel
11. https://clinicaltrials.gov/study/NCT05144386
12. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1567134823000175
13. https://www.frontiersin.org/journals/immunology/articles/10.3389/fimmu.2023.1295523/full
14. https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(17)30274–6
15. https://innovativegenomics.org/crisprpedia/crispr-in-agriculture/
16. https://link.springer.com/article/10.1007/s10068-022–01082‑3
17. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.12837
18. https://www.frontiersin.org/journals/oncology/articles/10.3389/fonc.2020.01387/full
19. https://www.technologyreview.com/2019/12/03/131752/chinas-crispr-babies-read-exclusive-excerpts-he-jiankui-paper/
20. https://www.jacionline.org/article/S0091-6749(19)32107–4/fulltext
21. https://www.nature.com/articles/s41467-021–24790‑6
22. https://www.leibniz-gemeinschaft.de/fileadmin/user_upload/Bilder_und_Downloads/%C3%9Cber_uns/Europa/G6_In-depth_statement_NGT.pdf
