文|面包夹知识

编辑|面包夹知识

«——【·前言·】——»

我国2022年海水养殖对虾总产量为166万t，其中凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)产量134万t，是主要的养殖品种。

病害问题一直是限制对虾产业发展的主要瓶颈之一，尤其高密度养殖环境下，弧菌病频发经常造成严重经济损失。

抗生素在水产养殖中长期使用，对环境和水产品造成的安全隐患尤其是耐药基因传播风险日益加剧，对其监管也愈发严格。

因此，水产养殖迫切需要生态友好的减抗和替抗方案，而有益微生物或益生菌替代抗生素则是最主要策略之一，其中具有拮抗病原活性的益生菌在生物防控水产病害上更具优势。

最近十几年，益生菌在水产养殖中已广泛使用并取得显著成效，水产益生菌主要包括芽孢菌、光合细菌、乳酸菌和酵母菌等多种不同类型微生物。

其中芽孢杆菌属(Bacillus)细菌特别是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)因其繁殖速度快、能产生多种酶类和低毒性抗菌物质、可形成抗逆性强的休眠孢子。

这对水产动物安全性高并具有多重益生功能，是最常用的水产益生菌种之一，在促进对虾生长免疫、防控病害和改善水质等方面已取得显著效果。

近年来水产动物宿主相关，尤其肠道来源益生菌，因其更容易粘附和定植于肠道进而发挥抑制病原和增加免疫等功能而倍受关注。

芽孢杆菌防控对虾弧菌病方面研究，已有较多报道，例如，在加拿大，很多的养殖场，都用益生菌养殖处理虾苗、因为这样，幼虾或成虾数天至数周后，其对病原弧菌感染的抵抗效果要多。

而少见利用对虾肠源拮抗活性的芽孢杆菌，直接控制对虾幼体弧菌病的研究报道。

我们从对虾肠道分离，筛选到一株拮抗病原弧菌效果明显的枯草芽孢杆菌，评价其对凡纳滨对虾幼体弧菌病的控制效果，为水产益生菌资源挖掘及其应用于对虾弧菌病防控提供参考。

«——【·材料与方法·】——»

菌株及培养基副溶血弧菌LC、哈维氏弧菌(V.harveyi)2018B22和坎氏弧菌(V.campbellii)Vca2为实验室保存的对虾病原弧菌；大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC25922，用作药敏实验参考菌株。

2216E培养基：蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，FePO40.01g，陈海水定容到1000mL，pH7.6~7.8，固体加18g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。。

其分离细菌用对虾为广东湛江沿海采集的4批不同来源健康凡纳滨对虾。

感染实验用对虾为，湛江某公司生产的凡纳滨对虾无节3期幼体，不携带白斑综合征病毒、急性肝胰腺坏死性副溶血弧菌、虾肝肠孢虫等特定病原。

对虾幼体饵料为螺旋藻粉(500g/罐)和虾片(1kg/包)，取同一批来源对虾4只，消毒对虾体表，无菌操作逐一取出虾肠转入4只无菌EP管中，用无菌竹签蘸取肠道内容物。

于2216E平板上划线分离细菌，每份虾肠样品划2～3块平板，30℃倒置培养3d，每天观察，并从同一虾肠分离平板中挑取不同特征的菌落以2216E平板进一步划线纯化。

纯化后的分离物分别转接于TCBS平板和哥伦比亚血凝脂平板上，30℃培养。

TCBS平板上24h内生长明显的菌落直接作为弧菌淘汰，血琼脂平板上2d内出现溶血现象的分离物则作为潜在致病菌也被淘汰。

现象的菌株，参考以2216E琼脂为底层和TCBS琼脂为上层的双层平板法测试各菌株对副溶血弧菌LC、哈维氏弧菌2018B22和坎氏弧菌。

Vca2的拮抗活性，每株菌各做3次重复测试，根据待测菌株抑菌圈直径与其菌落直径比值大小选择拮抗活性最强的菌株作为潜在益生菌。

将目标菌株(LJ)在2216E平板上划线，30℃培养24h，观察记录菌落特征，挑少许菌苔进行革兰染色，显微镜油镜观察细胞形态特征。

采用BIOLOG公司GenⅢ微孔板参考其说明书对目标菌株进行鉴定。利用细菌DNA提取试剂盒提取LJ基因组DNA。

方法以通用引物(27F和1492R)PCR扩增LJ的16SrRNA基因。

«——【·结果与分析·】——»

最初用2216E平板从4批对虾肠道分离纯化了51株细菌，其中大多数(33株）分离菌可在TCBS平板上生长良好或在血琼脂平板上有(α或β)溶血现象。

或兼而有之，这些被视为潜在致病菌株而被淘汰，去除来源相同且菌落特征一致的冗余菌株后，保留8株既非弧菌也无溶血活性的代表菌株。

它们对3种病原弧菌的拮抗效果见表1。

8株候选菌中只有LJ对3弧菌Vca2以及BH7对哈维氏弧菌2018B22也具有较强拮抗作用(图1)，但其抑菌圈与菌落直径比值均显著低于LJ对相应弧菌的比值(P<0.05)。

而其余5株候选菌对3种弧菌均无明显抑制作用或抑菌圈微弱，可见，无论是拮抗弧菌种类还是拮抗活性强弱，菌株LJ均是表现最优的潜在益生菌。

经革兰染色后，油镜下观察LJ细胞呈紫色短杆状分散排列，有的菌体中间有未着色的卵圆形芽孢，有的芽孢已成熟(图2)，判定为革兰阳性产芽孢细菌。

基于生理生化特征的Biolog鉴定系统对菌株LJ给出了4个鉴定结果，按相似性即SIM值高低依次为枯草芽孢杆菌枯草亚种、莫哈韦芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、深褐芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌斯氏亚种。

SIM值分别为81.8%、9.1%、5.7%和3.4%，可见，LJ与Biolog数据库中的枯草芽孢杆菌最相似。

菌株LJ基因组DNA经16SrRNA和rpoB基因引物扩增和测序后，分别获得约1413bp和633bp的有效序列，LJ的16SrDNA序列与EzBioCloud数据库中8种芽孢杆菌模式菌株相似性均≥99.65%。

其中与特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)、卡夫里亚莱斯氏芽孢杆菌(B.cabrialesii)和贫瘠水芽孢杆菌(B.inaquosorum)模式菌株序列都仅有1个碱基差异，与枯草芽孢杆菌模式菌株也只有2个碱基不同，无法确定LJ属于哪个种。

16S系统进化树(图3)上LJ先与特基拉芽孢杆菌聚为一个小的分枝，但置信值不到50%，再与卡夫里亚莱斯氏芽孢杆菌等4株菌在58%的置信水平聚为一个亚枝。

该亚枝与枯草芽孢杆菌等6株芽孢杆菌组成的亚枝聚集为一个大分枝，其置信值也不到50%，可见16S系统树上也无法确定LJ是哪种芽孢杆菌。

LJ的rpoB序列在NCBI数据库比对最相似的前100株菌中有98株是枯草芽孢杆菌，包括相似性最高的10株菌(表2)。

综合以上表型和分子特征，可将LJ鉴定为枯草芽孢杆菌药敏实验结果显示，菌株LJ只对所测试17种常用抗生素中的利福平表现耐药性，对阿莫西林、呋喃唑酮、氨苄青霉素、多粘菌素B和环丙沙星的耐药性表现为中介。

对其他11种抗生素均表现敏感(表3)，这表明菌株LJ对常用抗生素耐药性低，无多重耐药现象。

由图4可知，感染72h后，只加副溶血弧菌LC的病原对照组对虾幼体存活率只有12.33%，加LC同时添加枯草芽孢杆菌LJ的T1组和T2组幼体存活率均显著高于LC组。

尤其添加较高剂量LJ(1×106cfu/mL)的T2组存活率(51.83%)，不仅显著高于添加较低剂量LJ(1×105cfu/mL)的T1组(P<0.05)，

LJ可有效提高副溶血弧菌感染凡纳滨对虾幼体的存活率和变态率，且较高剂量LJ效果更明显。

此外，只加高浓度LJ(5×107cfu/mL)测试其安全性的LJ组幼体存活率(85.33%)(图4)和Z3变态率(36%)(图5)在各组中均最高，且幼体活力强，变态率显著高于其他各组(P<0.05)。

多重比较时LJ与CK组存活率差异虽不显著(P>0.05)，但单独与CK组进行T检验分析，LJ组存活率则显著高于CK组(P<0.05)。

这表明LJ对凡纳滨对虾幼体安全性高，并可有效促进幼体发育和存活。

«——【·结语·】——»

弧菌病是对虾养殖中最常见的细菌性病害，是由弧菌属的一些致病或条件致病性弧菌如副溶血弧菌、哈维氏弧菌、坎氏弧菌和溶藻弧菌(V.algino‐lyticus)等感染所致。

从幼体到虾苗再到养成期乃至亲虾均频繁发生，危害严重，防控困难。

当前我国水产养殖可用抗生素仅有13种，抗生素防治效果有限，对环境和食品安全存在隐患。

对虾为无脊椎动物，无特异性免疫系统，难以用接种疫苗方式预防弧菌病，生物防控水产病害，环境友好，可操作性强，是当前和今后防控病害的主要趋势之一。

对虾弧菌病的生物防控方式包括益生菌、噬菌体、微藻、药用植物和生物絮团等，其中益生菌最具有代表性。

水产益生菌以往多沿用人或畜禽用菌种，但不同来源菌种甚至同种不同菌株在适应能力和功能上可能存在明显差异，需要结合养殖品种和养殖环境选用适合菌种和菌株。

不过，美国水生物专家发现，基于对虾肠道中具有拮抗活性的土著菌在防控弧菌病上更具优势，从凡纳滨对虾肠道分离细菌，以副溶血弧菌等3种常见对虾病原弧菌为拮抗对象，筛选到一株对3种弧菌均具有明显拮抗作用的潜在益生菌株LJ。

菌种鉴定是益生菌研究和生产中的最重要环节之一，可靠的菌种鉴定，可有效利用相关菌种已有信息对其安全性和应用潜力进行初步评估。

通过形态特征可快速确定LJ为产芽孢的杆菌，基于生理生化特征的Biolog鉴定基本确定LJ最可能是枯草芽孢杆菌，但也不能完全排除是其他芽孢杆菌的可能性。

16SrRNA基因是鉴定细菌最常用的分子方法，但其在种水平上的区分能力有限。

研究LJ的16SrRNA基因与包括特基拉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌在内的4种芽孢杆菌模式菌株序列上只有1-2个碱基差异，无法确定具体种。

rpoB基因编码RNA聚合酶的β亚基，对细菌DNA转录和存活至关重要，在大多数细菌基因组中只有单一拷贝，在种水平上可有效区分芽孢杆菌。

本研究通过rpoB基因序列进一步确定了菌株LJ为枯草芽孢杆菌，以此摄入外来基因以塑造更有效适应特定生态环境的基因型，具有丰富的种内多样性，被视为“通才型”(generalist)微生物的典型代表。

在土壤、海洋、植物根际及内部、陆生和水生动物肠道等环境都能分离到。

本研究分离的LJ可能是一株能适应对虾肠道环境的枯草芽孢杆菌，今后可通过定植实验、基因组测序和比较基因组学分析予以验证。

安全性是任何益生菌的首要关注点，尽管枯草芽孢杆菌是公认的安全性高的细菌，也是最广泛使用的水产益生菌种，仍然很有必要评估其安全性。

特别是水产益生菌通常以大量活菌形式添加到养殖系统，可能通过水平基因转移等方式获得或传播耐药基因。

对来自海水养殖系统的37株芽孢杆菌检测结果发现，其中4株菌在血琼脂平板上表现溶血性，有16株菌对13种抗生素中的3种以上呈现耐药性，多重耐药率达43.2%。

排除溶血和多重耐药菌株，结合对病原拮抗等特征，筛选到1株候选益生菌Bs4，通过高浓度Bs4浸浴处理体长约6cm的凡纳滨对虾，7d内无死亡现象，证明Bs4的安全性。

本研究在筛选过程中首先淘汰具有溶血性以及可能是弧菌的潜在致病菌。

本研究以敏感性更高的对虾溞状期幼体为对象，发现高浓度LJ不仅对幼体无害，反而有效促进了幼体存活和发育，进一步证明LJ作为对虾益生菌安全性可靠。

此外，无论有无拮抗病原活性，包括枯草芽孢杆菌在内的芽孢杆菌益生菌通常也能促进对虾幼体存活和变态，这与芽孢杆菌本身具有抑制病原、促进水产动物消化和免疫、改善肠道菌群和养殖水质等多重功能有关。

源自对虾肠道的枯草芽孢杆菌LJ生物安全性高，拮抗对虾病原弧菌活性强，可有效防治副溶血弧菌对凡纳滨对虾幼体的感染，是一株在生物防控对虾幼体弧菌病中具有应用前景的益生菌。